Morfología de nauplios y protozoeas1 de Litopenaeus vannamei y su relación con potenciales vías de colonización del tracto digestivo.

Nuno Simões1, Ana Roque2 & Bruno Gomez-Gil2*

El inicio de la alimentación exógena en las larvas de camarones peneidos ha sido identificado como una fase crítica en términos de su sobrevivencia, crecimiento y desarrollo, ya que las larvas son expuestas internamente a comunidades microbianas por primera vez durante la muda de Nauplio5 a Zoea1. La exposición a la dinámica de la comunidad bacteriana presente en el agua en ese momento puede tener efectos benéficos o perjudiciales en la capacidad digestiva y de asimilación de las larvas, en su nutrición, así como en su habilidad para sobrellevar el contacto con cepas patógenas presentes en el agua. En el presente trabajo se presentan los resultados de observaciones anatómicas realizadas a partir de técnicas histológicas y microscopía electrónica de barrido y su relación con las rutas de la primera colonización bacteriana del intestino.

Materiales y Métodos
Nauplios2-3 de Litopenaeus vannamei provenientes de tres lotes independientes fueron perfectamente enjuagados en agua de mar estéril (filtrada 0.45 µm y esterilizada con, autoclave) sobre una red con 150 mm de luz de malla. Fueron desinfectados utilizando yodo activado en una concentración de 10 µg/mL (Argentyne a 10 %) durante 15 min., enjuagados nuevamente y mantenidos en un contenedor plástico blanco de 12 L lleno con agua de mar esterilizada con 20 µg/mL de enrofloxacina como antibiótico (Cheminova de México, México) de acuerdo a la concentración mínima de inhibición y la concentración de "no-efecto" reportadas. Para la aireación se utilizó una pipeta de vidrio esterilizadas a través de la cual entraba aire filtrado a 0.22 µm. La temperatura se mantuvo constante en 28±1 oC mediante un baño de agua dulce termoregulado. Las Zoeas1 que se alimentan por primera vez (Zoeas tempranas o recién mudadas) se obtuvieron entre 36-48 h después de una incubación en agua de mar tratada con antibióticos. Las Zoea1 y Zoea2 fueron alimentadas a base de una combinación de microalgas con Chaetoceros muelleri (60%), Tetraselmis sp. (30%) y Isochrisis galbana (10%) en una concentración aproximada de 50,000 células ml-1, con 0 % de recambio de agua. Las microalgas fueron cultivadas axenicamente, aunque muestras del agua de cultivo fueron sembradas para confirmar que Vibrios no eran introducidos. Las muestras para microscopía electrónica de barrido fueron fijadas, deshidratadas y montadas de acuerdo a la metodología descrita por (Felgenhauer, 1987). La preparación histológica de las muestras se hizo siguiendo el procedimiento estándar de la tinción por haematoxilina-eosina-floxina sin descalcificación y de la tinción bacteriana de Gram-Humberton. La nomenclatura empleada para describir las larvas fue acorde a los términos definidos por Lovett & Felder (1989).

Resultados y Discusión
Morfología de Nauplio5
La apertura de la boca no fue observada en ninguno de los especimenes revisados con las técnicas histológicas y de MEB. Sin embargo, en las preparaciones histológicas se observaron evaginaciones del intestino medio en dirección ventral hacia la región de la boca, indicando que el proceso de formación de la boca estaba por ocurrir (Fig. 1 D, E2). Tampoco se observó la presencia de una boca como tal en las observaciones de MEB, aunque fue posible identificar cierta invaginación hacia la boca y el primordio del intestino anterior (Fig. 1 H2). En un Nauplio5 mudando a Zoea1 (Fig. 1 J1, J2) se observaron lo apéndices de alimentación emergiendo a través de tejido rasgado, lo que pudiera coincidir con el momento de apertura de la boca. Lovett & Felder (1989) establecen que el intestino anterior no se comunica con el medio sino hasta Zoea1, cuando se completa el proceso de formación del intestino y la larva comienza a alimentarse.

Observaciones microscópicas de Nauplio5 vivos mostraron que el intestino primordial, un tubo simple con lumen claramente abierto (Fig. 1 A, F) y alguna actividad peristáltica, puede estar presente desde el estadio Nauplio5, y que se diferencia progresivamente para conformar regiones distinguibles tales como los primordios de los ciegos anteriores y laterales del intestino medio, el tronco del intestino medio y el intestino posterior (Fig. 1 A, B). Estas observaciones fueron posteriormente confirmadas a partir de los cortes histológicos de Nauplios5 tardíos, donde tanto los ciegos anteriores y laterales como el tronco del intestino medio fueron identificados claramente (Fig. 1 D, F, G2). Estos resultados contradicen lo reportado por Lovett y Felder (1989), donde establecen que las paredes del intestino anterior se encuentran colapsadas detal forma que no existe un lumen y el intestino medio no puede distinguirse en el estadio de Nauplio5. Aunque esta discordancia puede ser el resultado de diferencias en el desarrollo de las especies, es mas razonable pensar que las muestras descritas por los autores no se encontraban en un estadio de Nauplio5 tardía, ya muy cercanos a la muda a Zoea1. Las vacuolas de yema descritas por Zilch (1978) para estadio tempranos de Nauplio en Penaeus trisulcatus son factibles de verse desarrolladas en los primordios de los ciegos anteriores y laterales del intestino medio observados en la Fig. 1 (A, B, D, E1, E2 y F).

Las fibras del músculo que dilata el recto, que se encuentran alrededor de las células quitinizadas del intestino posterior, así como las contracciones y distensiones típicas de la actividad peristáltica de esta región, fueron observadas tanto en los Nauplio5 tardíos como en los estadios larvales posteriores (Fig. 1C). A pesar de que estas observaciones fueron confirmadas por los cortes histológicos de Nauplio5 tardíos, donde el intestino posterior fue identificado claramente (Fig. 1 E1, E2, G1 y G2), están en desacuerdo con las observaciones Lovett y Felder (1989), aunque estos autores generalizan sus comentarios para todos los estadios de Nauplio. En Nauplio5, antes de la muda a Zoea1, se observó de forma evidente el poro anal, junto con una clara diferencia entre las células epiteliales del tronco del intestino medio y las células quitinizadas del intestino posterior (Fig. 1, G1). La apertura anal en Nauplio5 fue confirmada con las observaciones de MEB de especimenes que fueron fijados y preservados al mismo tiempo que aquellos usados para los cortes histológicos (Fig. 1 H1, H3, I).

Las observaciones del presente trabajo revelan que el ambiente interno del intestino en estadio de Nauplio5 tardíos puede estar desde este momento expuesto a las condiciones externas. Aún cuando en el estadío de Nauplio5 todavía no ha ocurrido la apertura de la boca, el ano si se encuentra abierto, y la existencia de movimientos antiperistálticos ("anal drinking") demostrado por Lovett & Felder (1990) para los estadios inmediatos de Zoea1-3, sugiere fuertemente que desde Nauplio5 los tejidos internos del intestino posterior pueden estar en contacto con el ambiente externo y consecuentemente con las bacterias presentes en la columna de agua. Lovet & Felder (1990) proponen una explicación para la antiperistalsis ("anal drinking") en poslarvas de camarón en donde esta actividad esta por un lado asociada a la expansión anterior de los microtúbulos del hepatopáncreas mediante presión hidráulica, y por otro ayuda en la defecación. El agua que entra por el ano puede ser llevada hasta la zona anterior del intestino medio. Esto sugiere que la apertura del poro anal antes que la boca pudiera servir como la entrada principal de agua hacia el tubo alimenticio primitivo, expandiéndolo y generando alguna presión hidráulica hacia los ciegos. Asumiendo que los tejidos internos de los huevos y Nauplios tempranos son estériles, las implicaciones ecológicas de estas observaciones son que varias horas antes de que comience una actividad alimenticia normal en el estadio de Zoea1, los ciegos anteriores y laterales en desarrollo y el tronco del intestino medio y posterior pueden estar recubiertos con las bacterias presentes en el agua en ese momento. Así mismo, estos resultados también sugieren que los mecanismos de osmoregulación observados en estadios larvales posteriores deben ser muy similares a lo largo de todo el desarrollo ontogénico.

Morfología de Zoea1
A pesar de que no se logró observar un corte histológico que claramente mostrara la boca de una Zoea1, la observación de Zoea1 recién mudadas (Fig. 2 A1 y B), consumiendo microalgas (Fig. 2B, C y G), junto con los cortes histológicos mostrando la presencia de heces en los ciegos anteriores y laterales, el tronco del intestino medio y posterior (Fig. 2H, I y J), así como las observaciones de MEB mostrando defecación (Fig. 2F), demuestran que las Zoea1 son capaces de ingerir microalgas desde algunos minutos después de la muda. Por lo tanto, es muy factible la ingestión accidental de bacterias ya sea adheridas a las células de algas o libres en la columna de agua.

El tronco del intestino medio de Zoea1 y Zoea2 Litopenaeus vannamei es anatómicamente muy similar a las descripciones hechas por Lovett & Felder (1989) para Litopenaeus setiferus. Este consiste en un simple tubo recubierto en su interior con células epiteliales y dos pares de ciegos que son similares tanto en estructura como en tamaño.

El intestino posterior de Zoea1 ya se encuentra bien diferenciado cuando se compara con el poro anal de Nauplio5. En los estadios de Zoea y durante todo el desarrollo posterior se mantiene como un simple tubo con células quitinizadas y una unión con el tronco del intestino medio a la altura del VI segmento abdominal. El ano presenta un área ornamentada con espinas cortas organizadas en líneas que, junto con los movimientos peristálticos fuertes y frecuentes del intestino posterior soportados por las fibras del músculo que dilata el recto, ayudan a evacuar los cordones fecales (Fig. 2 E2, F y G). Es posible que una presión lateral ejercida sobre las líneas de espinas ayudan a romper los cordones fecales en pedazos más pequeños. Estos resultados confirman las observaciones de la cinemática del intestino realizadas por Lovett & Felder (1990).

Cabe hacer notar que a diferencia del crecimiento y desarrollo intermitentes de el intestino anterior y posterior quitinizados los cuales están restringido a la ecdisis, el desarrollo del intestino medio es mas gradual y cualquier residente bacteriano permanente se encontrará adherido preferentemente a esta superficie, ya sea en el tronco del intestino medio o bien dentro de los ciegos anteriores y laterales. Las Zoea1 saludables, en un ambiente con alimento abundante se alimentarán casi permanentemente, introduciendo alimento nuevo al intestino anterior y dejando pasar algunas partículas directamente hacia el intestino medio y otras pasando cierto tiempo en los ciegos anteriores y laterales. Por otra parte, la entrada de agua a través de la boca ("oral drinking") ocurre a partir de ondas peristálticas regulares a lo largo del esófago aún cuando el alimento no esta siendo ingerido, tal y como fue descrito para todos los estadios de desarrollo de Litopenaeus setiferus. Ambos mecanismos contribuyen a la entrada de bacterias hacia el tracto digestivo de las larvas. Entonces el alimento digerido es empacado en la membrana peritrófica mediante ondas de contracción peristáltica y antiperistáltica y eventualmente expulsado al exterior a través del intestino posterior.

En tanto que la membrana peritrófica puede proteger el epitelio delicado del tronco del intestino medio de materiales abrasivos ingeridos, Lovett & Felder (1990) también observaron que el intestino medio juega un papel preponderante en la separación del quimo y la materia fecal del agua extraperitrófica que es introducida a través del ano y transportada hacia la parte anterior para expandir el intestino medio. Por lo tanto, las bacterias que sobreviven la digestión, y que se encuentran presentes en el quimo y la materia fecal, seguramente serán expulsadas hacia el exterior, mientras que la nueva colonización del epitelio absorbente del tronco del intestino medio se logra gracias a la entrada continua de agua a través del ano.

Conclusión
Los Nauplios5 de camarón ya presentan un poro anal con movimientos antiperistálticos ("anal drinking") que puede permitir la colonización del tracto digestivo por bacterias presentes en la columna de agua antes de que la boca se abra al medio exterior y comience la actividad normal de alimentación.

1. Laboratorio de Ecologia y Biologia Marina Experimental, Facultad de Ciencias, UNAM, Ciudad del Carmen, Campeche, Mexico. E-mail: nunosimoes@prodigy.net.mx
2. CIAD, A.C. Mazatlán Unit for Aquaculture and Environmental Management. AP. 711 Mazatlán, Sinaloa 82000 México.