Panorama Acuicola 

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Descripción de la bacteria Vibrio parahaemolyticus, el agente causante del EMS en camarón.

Artículos y entrevistas30 de noviembre de 2016

El EMS es uno de los agentes patógenos que más ha afectado a la industria camaronícola en los últimos años. El análisis comparativo con otras cepas de V. parahaemolyticus y de la patogenicidad de la cepa EMS a diferentes niveles permitió conocer más sobre esta enfermedad y proporcionar información útil para el desarrollo de estrategias de mitigación.

Por: Moonyoung Choi1, Ann M. Stevens2, Stephen A. Smith3, Daniel P. Taylor1 y David D. Kuhn1 

Durante los último años, los brotes de enfermedades en el sector camaronícola a nivel mundial han generado inmensas pérdidas entre los productores; hoy en día, el sector está en recuperación pero se ha vuelto fundamental conocer más sobre los agentes patógenos que amenazan la producción de camarón alrededor del mundo para desarrollar  estrategias de manejo y control que reduzcan el impacto de estos agentes patógenos.   
Síndrome de Mortalidad Temprana – EMS En 2009, surgió una nueva cepa de la bacteria marina V. parahaemolyticus, esta cepa patógena es la causante de la enfermedad de la necrosis aguda del hepatopáncreas (AHPND) o comúnmente conocida como síndrome de mortalidad temprana o EMS (por sus siglas en inglés). Este patógeno se dio a conocer rápidamente por las mortalidades masivas que causaba en los estanques durante las primeras etapas del cultivo. Hasta el momento, existe poca información sobre las características del crecimiento y patogenicidad de las diferentes cepas de V. parahaemolyticus; es por ello que se decidió evaluar tres cepas diferentes de V. parahaemolyticus en Litopenaeus vannamei, una de las especies de camarón de mayor importancia comercial. La  primer cepa fue la del EMS (13-028/A3), la cual se obtuvo de uno de los brotes de la enfermedad en Vietnam. La segunda cepa fue RIMD2210633 (RIMD), aislada de un caso clínico humano de “diarrea del viajero” en Japón en 1996;  y la tercera, LM5312 (LM), fue aislada del medio ambiente en Bangladesh en 1984. Además del análisis comparativo entre cepas, se examinó la patogenicidad de la cepa EMS en camarón a diferentes niveles de inoculación por medio de un ensayo de desafío de la enfermedad. Fue especialmente importante que el ensayo de desafío durara varios días, para así obtener información útil que pueda ayudar a desarrollar estrategias eficaces de mitigación, y así minimizar la exposición y efectos de esta enfermedad en las granjas de cultivo.
Las instalacionesPara el estudio, se utilizaron juveniles (2-4 g) de camarón blanco, Litopenaeus vannamei, los cuales se colocaron en un acuario de 75 litros equipado con un sistema de filtración por recirculación y aeración. Se realizó un monitoreo constante de los parámetros del agua (temperatura, amonio, nitritos, salinidad, pH), ajustándolos cada que era necesario. Los camarones se alimentaron diariamente con una dieta comercial a una tasa correspondiente al 3 % del peso corporal de los camarones. 
Preparación de la prueba  Las tres cepas de V. parahaemolyticus se cultivaron en caldo o agar de tripticasa de soya complementado con NaCl para logra la salinidad característica del agua utilizada en el cultivo de camarón (25 ppt). Una vez preparados los “iniciadores” de las cepas de V. parahaemolyticus se obtuvieron sus curvas de crecimiento utilizando un lector de microplacas multimodo durante un periodo de 24 horas. Todas las exposiciones de los camarones a V. parahaemolyticus se realizaron en un gabinete de bioseguridad siguiendo los protocolos de bioseguridad adecuados. Para las pruebas, se prepararon vasos de precipitado con agua salada para contener a los camarones inoculados. Para determinar las dosis de inoculación de V. parahaemolyticus se consideró la disparidad de las tallas de los camarones, por lo que se estableció una dosis de alimento por gramo de peso. Antes de iniciar con las pruebas, no se alimento a los camarones 48 h antes para asegurar el consumo rápido de los tratamientos. Los pellets se cubrieron con el líquido inoculado, previamente preparado con las distintas cepas de V. parahaemolyticus, y posteriormente fue proporcionado a los camarones. Adicionalmente, se tomaron muestras de tejidos de camarones infectados con EMS y del tratamiento control TSB2+ para realizar un análisis histopatológico. 
Resultados Como se puede observar en la Figura 1, las tres cepas mostraron tasas de crecimiento exponencial similares, a pesar de que la cepa EMS tuvo una fase de crecimiento retardada al inicio. Sin embargo, al final la cepa EMS alcanzó un mayor rendimiento de crecimiento con una densidad óptica (DO) más alta. En la Tabla 1, el número ubicado a un lado del nombre del tratamiento (ej. EMS, 5x108) representa el número de células viables (UFC ml-1) que se registraron en cada uno de los tratamientos. Como se puede observar en la prueba A, la cepa EMS registró un mayor número de células viables en comparación con las otras cepas. Esto sugiere que las cepas RIMD y LM pierden viabilidad durante su fase estacionaria de crecimiento, mientras que la cepa EMS sigue siendo viable, evidencia de ello es que a las 48 h de la prueba A se registró 0 % de sobrevivencia con la cepa EMS frente a 100 % de las otras cepas. Para poder comparar de forma mas equitativa la patogenicidad de las tres cepas, estas se cultivaron hasta lograr un número equivalente de células viables a una DO600=0.5 (Prueba B, Tabla 1). Los tratamientos control y RIMD registraron una supervivencia del 100 %, y no se reportaron diferencias significativas entre las tasas de sobrevivencia de las tres cepas en comparación con el tratamiento control. En la prueba B se comprobó que la cepa EMS es la más virulenta, pero no tan virulenta como en la Prueba A, esto refleja niveles variables de producción de toxinas en las diferentes etapas del crecimiento bacteriano. En las pruebas C y D (Tabla 1), las cepas RIMD y EMS se cultivaron durante 12 h o DO600=6.0 antes de ser expuestas a los camarones. La cepa LM no se utilizó en esta prueba, ya que como fue aislada del medio ambiente no se logró cultivar en medio sólido y mostró los niveles más bajos de virulencia en las pruebas anteriores. En ambas pruebas (C y D), la cepa EMS fue la más letal, en la prueba C se registró una mortalidad del 100 % a las 24 h de la exposición, y en la prueba D, se registró una mortalidad del 100 % al finalizar las 96 h  de la prueba (Tabla 1). La cepa RIMD no registró mortalidades en ninguna de las pruebas. Lo que sugiere que sus toxinas no son efectivas en camarones, caso similar al de la cepa LM. 
Patogenicidad del EMS Dado que existe una clara dependencia entre el número de células viables de EMS y la gravedad de la enfermedad fue necesario desarrollar un ensayo letal o subletal de desafío de la enfermedad. Para el cual se realizaron dos pruebas independientes con una duración de 96 h cada una, en las cuales se utilizaron diluciones de cultivos de 18-h de la cepa EMS. Se definieron cinco tratamientos con cinco réplicas cada uno: control negativo (TSB2+), EMS sin disolvente (control positivo), EMS diluido 1/10, EMS diluido 1/100 y EMS diluido 1/1000. Al finalizar el ensayo , el grupo control TSB2+ registró una sobrevivencia del 100 %, y se registraron diferencias significativas en las tasas de sobrevivencia de los camarones alimentados con pellets inoculados con las diluciones de EMS, principalmente el tratamiento control positivo y 1/10 en comparación con el control negativo en ambas pruebas.  Mientras que no se registraron diferencias significativas en las tasas de sobrevivencia con las disoluciones de EMS 1/100 y 1/1000 en comparación con el tratamiento control negativo TSB2+ en ambas pruebas. La histopatología del hepatopancreas de los camarones infectados por EMS fue similar a los hallazgos publicados anteriormente. La infiltración hemocítica aumento debido a la presencia de EMS, debido a que los hemocitos son capaces de detectar enfermedades invasoras. Los hemocitos responden a las enfermedades usando fagocitos, para después descargar péptidos antimicrobianos (AMP, por sus sigas en inglés) como lisozimas y lectinas. Lo que indica una interrupción en la digestión, ya que las células B son las principales productoras de enzimas digestivas. Además de confirmar que el EMS afecta principalmente el hepatopáncreas del camarón, se observó necrosis y desprendimiento de células epiteliales tubulares con infiltración hemocítica en los tejidos circundantes al caudal del intestino medio, lo que no se había reportado anteriormente para la enfermedad del EMS. 
Conclusión Uno logro notable de este estudio es que se estableció un protocolo para los ensayos de desafío subletales a enfermedades a través de la disminución del número de células viables de la cepa EMS utilizadas en la inoculación. Regularmente, los ensayos de toxicidad letal se usan sólo para detectar toxicidad general y efectos de la enfermedad, y a menudo son demasiado rápidos y no proporcionan datos realistas que permitan desarrollar estrategias de mitigación que sean aplicables en la práctica. Este estudio demostró que la cepa EMS alcanza mayores concentraciones de células viables en periodos de tiempo más prolongados en comparación con las cepas RIMD y LD de V. parahaemolyticus. Como se esperaba, la cepa EMS fue la más virulenta al producir niveles más altos de patogenicidad aguda en los camarones. Y por primera vez, se reportaron los efectos adversos del EMS en el caudal del intestino medio de los camarones. 

1Departamento de Ciencias y Tecnología de Alimentos, 2Departamento de Ciencias Biológicas y 3Departamento de Ciencias Biomédicas y Patología, Virginia Tech Institute, EE.UU. 
Moonyoung, C., Stevens, A., Smith, S., Taylor, D., Kuhn, D. (2016). Strain and dose infectivity of Vibrio parahaemolyticus: the causative agent of early mortality syndrome in shrimp. Aquaculture Research, 1-9



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