Panorama Acuicola 

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Identifican virus causante de muertes masivas de tilapia

Artículos y entrevistas01 de agosto de 2016

El nuevo virus orthomyxo, denominado TiLV (Tilapia Lake Virus), es responsable de muertes masivas en cultivos de tilapia en Israel y Ecuador. Gracias a la colaboración de un equipo de científicos internacionales fue posible su identificación y la descripción de sus secuencias genómicas y proteicas; con ello se facilita su contención y el desarrollo de vacunas.

Por: Eran Bacharach, Nischay Mishra, Thomas Briese, Michael C. Zody, Japhette Esther Kembou Tsofack, Rachel Zamostiano, Asaf Berkowitz, James Ng, Adam Nitido, André Corvelo, Nora C. Toussaint, Sandra Cathrine Abel Nielsen, Mady Hornig, Jorge Del Pozo, Toby Bloom, Hugh Ferguson, Avi Eldar, W. Ian Lipkin*
La tilapia juega un papel cada vez más importante en la seguridad alimentaria a nivel mundial; su dieta omnívora, su tolerancia a altas densidades de cultivo y su relativa resistencia a enfermedades la han hecho una de las principales fuentes de proteína animal, sobre todo en los países en desarrollo. Entre las más de 100 especies, el cultivo de la tilapia del Nilo (Orcheochromis niloticus) es el que predomina alrededor del mundo; se estima que la producción global es de 4.5 millones de toneladas métricas (TM) con un valor de USD$1,500 millones (MNX$28,000 millones) y se espera que para el 2030 su producción aumente a 7.3 millones de TM.Los principales productores (por orden) a nivel mundial son: China, Egipto, Filipinas, Tailandia, Indonesia, Laos, Costa Rica, Ecuador, Colombia y Honduras; mientras que Estados Unidos es el principal importador, consumiendo aproximadamente 225,000 TM anualmente. La industria de tilapia representa una fuente de proteína de bajo costo, así como una fuente importante de empleo en los países en desarrollo.En general, las enfermedades que afectan los cultivos de tilapia son de origen bacteriano o por hongos, y se combaten con el uso de antibióticos y otros tratamientos. Hasta antes del 2010 no había sido necesario desarrollar tratamientos para infecciones virales, ya que no se habían identificado amenazas de este tipo en el cultivo de esta especie.Desde el 2009, la acuicultura de tilapia se ha visto amenazada por muertes masivas en cultivos en Israel y Ecuador. La distante ubicación geográfica entre ambos brotes hace de este virus una importante preocupación para el sector a nivel mundial y gracias a la colaboración de un equipo internacional de científicos se logró identificar el nuevo virus orthomyxo denominado TiLV (Tilapia Lake Virus, por sus siglas en inglés) implicado en estos brotes.La investigación realizada a los brotes en Israel reportó un síndrome que comprende letargo, endoftalmitis, erosiones cutáneas, congestión renal, encefalitis y se demostró que es contagioso. Pese a que la investigación de los brotes en Sudamérica se enfocó en el hígado, y la de Israel en el sistema nervioso central, la comparación de las secuencias obtenidas en ambos casos revela que se trata de virus similares.Se ha descubierto que el TiLV es un virus ARN con un genoma compuesto por 10 segmentos únicos. Uno de los 10 segmentos presenta homología a la subunidad PB1 del virus de la influenza C, mientras que los otros nueve segmentos no mostraron homología con ningún virus conocido; aun así, muestran secuencias complementarias consistentes con la organización característica de los virus orthomyxo. El virus cultivado en células E-11(sub-cultivo clonado de línea celular de pez cabeza de serpiente) mostró sensibilidad a éter y cloroformo indicando que el virus está envuelto en una capa de lípidos.El presente artículo describe el nuevo virus aislado en Israel. Por medio de secuenciación de alto rendimiento (UHTS, por sus siglas en inglés), hibridación Northern, espectrometría de masas, hibridación in situ e infectividad se logró definir que el TiLV es un virus ARN segmentado de sentido negativo.
Resultados obtenidos durante la investigaciónPara la secuenciación de alto rendimiento y análisis bioinformático se utilizaron extractos de ARN del cerebro de tilapias infectadas para la secuenciación Ion Torrent, mientras que para la secuenciación Illumina se utilizaron partículas de E-11 infectadas. Las lecturas obtenidas de la secuenciación Ion Torrent e Illumina se clasificaron taxonómicamente utilizando TaxMaps, mapeándolas contra las bases de datos National Center of Biotechnology Information (NCBI) y NCBI RefSeq, y las secuencias de referencia del genoma y del mARN de tilapia.Las secuencias no clasificadas, es decir, las que no fue posible mapear con ninguna secuencia conocida, fueron ensambladas independientemente. Se realizó un análisis BLAST, alienando los contigs de cada librería contra contigs de 3 librerías diferentes para así identificar las secuencias similares que pudieran derivarse del mismo segmento, de la misma especie de virus, en diferentes muestras.Se identificaron 10 grupos de contigs que contenían al menos un contig de cada una de las librerías. Dentro de cada grupo, los contigs fueron alineados entre sí y montados manualmente para generar una secuencia de longitud máxima después de remover las duplicaciones invertidas en tándem de los extremos de los contigs. Basado en un modelo en el que se prevén los segmentos genómicos que contienen terminales conservadas, se utilizó una combinación de análisis de k-mer, análisis de lectura profunda y curación manual para construir los motivos terminales de las secuencias 5’ y 3’, y de esta manera refinar las secuencias terminales. El mapeo de los datos iniciales de lectura en bruto contra el consenso de las 10 secuencias finales con BWA-MEM demostró que el 99 % de las lecturas no identificadas se leen de las librerías Illumina y el 87 % de las lecturas no identificadas se leen de la biblioteca Ion Torrent.Para la caracterización del genoma del TiLV se diseñaron y utilizaron iniciadores de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para amplificar fragmentos representativos de los 10 segmentos de ARN extraído de peces infectados y partículas purificadas del virus. Se utilizó la amplificación rápida de terminaciones de ADNc (RACE, por sus siglas en inglés) de los segmentos 5’ y 3’ para recuperar las secuencias terminales de los 10 clusters. Basado en la similitud en las secuencias terminales de cada uno de los clusters, se concluyó que los clusters representan 10 segmentos genómicos virales y en lo sucesivo hablaremos de ellos como segmentos del 1 al 10 (Tabla 1).El segmento 1 es el más largo con 1.641 kb y predice una proteína con homología débil a la subunidad PB1 del virus de la influenza C (≈17 % identidad de aminoácidos, 37 % cobertura del segmento). Los otros 9 segmentos no presentaron homología con otras secuencias de la base de datos de nucleótidos y proteínas del GenBank.Debido a la débil homología con el PB1, del segmento 1 se comparó el Marco Abierto de Lectura (ORF, por sus siglas en inglés) con polimerasa de la subunidad PB1 recuperada de miembros específicos de la familia de los Orthomyxoviridae. Una proteína putativa del segmento 1 mostró una débil homología con cuatro motivos conservados de polimerasa de ARN dependiente de ARN y polimerasa de ARN dependiente de ADN.La secuencia de nucleótidos de las regiones no codificantes 3’ y 5’ de los 10 segmentos fueron alineados utilizando el Software Geneious 6.8.1 (Figura 2). Trece nucleótidos en la terminación de la región 5’ y 13 nucleótidos de la región 3’ presentaron similitud en todos los segmentos, una organización semejante a la que se observa en los virus de la influenza. Diez de los 13 nucleótidos del segmento 5’ y 7 de 13 del segmento 3’ tuvieron 100 % de conservación, mientras que el resto de los nucleótidos fueron preservados en los segmentos 5 a 9. Las secuencias de nucleótidos presentaron características complementarias en los extremos 3’ y 5’.Gracias a la espectrometría de masas se confirmaron los ORFs y la codificación de péptidos para los segmentos del 2 al 10. Por un lado no fue posible detectar una secuencia que representara el segmento 2, mientras que los ORFs obtenidos del segmento 5 y 6 presentaron sitios con péptido señal entre aa 25/26 y 30/31, respectivamente.Comparando las secuencias de alto rendimiento y los resultados del análisis de una muestra de TiLV PCR-positivo de un pescado infectado de Ecuador con las secuencias de nucleótidos obtenidas en muestras de Israel se obtuvo 97.20-99.00 % de identidad de nucleótidos y 98.70-100 % de identidad de aminoácidos (Tabla 2).Fue posible comprobar la naturaleza segmentada del TiLV y el tamaño específico de sus segmentos por hibridación Northern de extractos de células E-11 infectadas con TiLV (aislado del cerebro) y del hígado de algunos peces.Con el fin de investigar la presencia de TiLV en peces, se utilizaron técnicas de hibridación in situ en muestras de cerebro e hígado. En el cerebro, las señales de hibridación del ARN (Figura 3A) y ARNm (Figura 3B) del segmento 1 del genoma se limitaron a los leptomeninges, sobre todo a los adyacentes a los vasos sanguíneos; resultados similares se obtuvieron para el ARN genómico y para el ARNm del segmento 5.En Israel, los controles ingenuos no infectados, de aproximadamente la misma edad, recolectados en una granja de cultivo distinta, no presentaron señales de hibridación en las secciones del cerebro. Mientras que en el hígado se detectaron señales de hibridación del ARNm del segmento 3. Se detectó ARNm de TiLV en ambos núcleos y en el citoplasma de múltiples células, pero no se detectó ARNm viral en las células control no infectadas.Con base a un análisis de secuencias y a una hibridación de ARN se estableció que el TiLV tiene un genoma de sentido negativo; lo que quiere decir que un genoma desproteinizado no debería ser infeccioso. Para probar lo anterior, se purificó ARN de células infectadas de E-11 y se trasfirió a células ingenuas E-11; como controles positivos, se transfirió virus de necrosis nerviosa (VNN, un virus ARN segmentado de sentido positivo que afecta a peces) a células E-11. Después de la transfección del ARN desproteinizado de TiLV a células ingenuas no se observó ningún efecto citopático, es decir, daño celular causado por la infección del virus; caso contrario a los controles positivos, los cuales presentaron efectos citopáticos después de la transfección de ARN desproteinizado de VNN.
TiLV, Tilapia Lake Virus, el nuevo virusGracias al presente estudio se logró caracterizar la biología molecular, la patogénesis y la distribución geográfica parcial del TiLV, virus implicado en las mortalidades recientes de tilapia en Israel y Ecuador. Los esfuerzos por clasificar el TiLV, por medio de análisis de homología de secuencias obtenidas a partir de los peces infectados y de células E-11, no tuvieron éxito, por lo que fue necesario el uso de otras técnicas para identificar y correlacionar la presencia de posibles genes y proteínas virales.A partir de los estudios realizados fue posible determinar que el TiLV es un virus ARN con un genoma compuesto por 10 segmentos únicos. El segmento 1, el más largo, presenta homología mínima con el segmento PB1 del virus tipo orthomyxo de la influenza C. Adicionalmente contiene la mayoría de los motivos de polimerasa, por lo que se especula que el segmento 1 codifica la polimerasa del TiLV; mientras que en los otros 9 segmentos no se encontró ninguna homología con otras secuencias virales ya conocidas. Sin embargo, conservan secuencias complementarias consistentes con la organización de los genomas característicos de los virus orthomyxo. El análisis de secuencias no logró proporcionar información acerca de su función en el ciclo de vida del TiLV, pero la hibridación in situ indicó que la transcripción se efectúa a través de una instalación nuclear.Es muy probable que el TiLV sea clasificado como un nuevo género de la familia Orthomyxoviridae. Los segmentos no codificados 3’ y 5’ del TiLV contienen 13 nucleótidos similares, organización similar a la influenza, Thogoto y al virus orthomyxo de la anemia infecciosa del salmón; esta organización permite el apareamiento de bases y formación de estructuras secundarias, las cuales son importantes para la replicación, transcripción y ensamblaje del ARN viral. El segmento 5’ también presentó un tramo corto e interrumpido de uridina, lo cual es una característica común entre los virus orthomyxos.Los resultados del presente estudio confirman la implicación del TiLV en las muertes masivas de tilapia en Israel y Ecuador. La presencia del virus en dos continentes distintos despierta una fuerte preocupación; por el momento no se tiene evidencia que el TiLV afecte a otras especies, sin embargo, la poca similitud del TiLV con otros virus sugiere que existe un gran potencial de descubrir nuevos virus con secuencias similares. Se requiere de más investigación del TiLV, ya que el entendimiento epidemiológico del virus, sus propiedades biológicas, su capacidad de contagio y las vías son cruciales para su contención, el desarrollo de futuras vacunas y la implementación de medidas de bioseguridad adecuadas.
*Título del artículo original: “Characterization of a novel orthomyxo-like virus causing mass die-offs of tilapia” | Sociedad Americana de Microbiología (2016).Contacto: Avi Eldar, eldar@int.gov.il, o W. Ian Lipkin, wil2001@cumc.columbia.edu



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