Panorama Acuicola 

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Efecto del biofloc en el crecimiento y actividad inmune en postlarvas del camarón blanco Litopenaeus vannamei

Artículos y entrevistas01 de junio de 2015

La tecnología de biofloc (TBF) reduce los impactos ambientales y la introducción de patógenos en los cultivos de camarón.

Por: Su-Kyoung Kim, Zhenguo Pang, Hyung-ChelSeo, Yeong-Rok Cho, In-Kwon Jang (Department of Aquaculture, National Fisheries Research & Development Institute, Incheon, Korea) &TzachiSamocha (AgriLife Research Mariculture Lab, Corpus Christi, TX, USA)*

La microbiota asociada al TBF detoxifica los nutrientes y mejora la utilización del alimento y el crecimiento.Los sistemas de biofloc contienen un abundante número de bacterias cuya pared se constituye de lipopolisacáridos, peptidoglucanos y 3-glucanos ß-1, los cuales estimulan al sistema inmune del camarón, además de servir como una fuente adicional de alimento.Existen beneficios al disponer de una comunidad bacteriana in situ en los sistemas de biofloc, pero se requiere una mejor comprensión de estos microorganismos, en particular a nivel molecular. Se realizó un experimento de 14 días con postlarvas de Litopenaeus vannamei, cultivadas en agua clara y en sistema de biofloc. Para determinar los niveles de expresión de mRNA del camarón seleccionamos seis genes (profenoloxidasa 1, profenoloxidasa 2, la enzima de activación de profenoloxidasa, serina proteinasa 1, proteinasa similar-enmascarada y proteína nuclear-ras) que están relacionados en una serie de respuestas conocidas como cascada de prophenol oxidasa (proPO), una de las mayores respuestas inmunes innatas en los crustáceos.Se encontraron respuestas significativamente diferentes en crecimiento y sobrevivencia entre los grupos cultivados en agua clara, en relación a los cultivados en sistemas de biofloc. Los niveles de expresión de mRNA fueron significativamente más altos en los sistemas biofloc que en el control de agua clara. Los resultados sugieren que la presencia de biofloc en el medio de cultivo aporta un efecto positivo en los genes de expresión relacionados con el crecimiento y el sistema inmune en las postlarvas de L. vannamei.
Palabras clave: Litopenaeus vannamei, genes de inmunidad, qRT-PCREl camarón blanco del Pacífico, Litopenaeus vannamei, es una de las especies más importantes en la acuicultura mundial. El cultivo de esta especie ha sido fuertemente afectado por enfermedades principalmente de origen viral, como el Síndrome de la Enfermedad de la Mancha Blanca (White Spot Syndrome Virus, WSSV, por sus siglas en inglés). Productores e investigadores buscan constantemente métodos para reducir las pérdidas masivas provocadas por desastres sanitarios. La aplicación de tecnologías de biofloc (TBF), en la camaronicultura, se ha propuesto como una herramienta que reduce el recambio del agua y minimiza la introducción de virus patógenos a través del flujo de entrada, y existen varios reportes de su uso.La tecnología del biofloc se basa en la producción de camarón con un nulo o mínimo recambio de agua, lo que resulta en la acumulación de sustratos orgánicos y el subsecuente desarrollo de una densa población de microbios, formando agregados de biofloc, que consisten en una variedad de bacterias, hongos, microalgas, detritus y otros organismos en suspensión. Estos microorganismos utilizan el exceso de nutrientes y adquieren un valor nutricional para las especies en cultivo; así, el biofloc es una fuente de lípidos, minerales y vitaminas para los organismos. Mediante el uso del método de marcado con isótopo 15N se ha demostrado que la proteína contenida en el biofloc es incorporada por tilapias y camarones en cultivo, y utilizada para su nutrición y para otros propósitos.La pared celular de hongos y bacterias se compone de lipo polisacáridos (LPS), peptidoglicanos (PG) y ß-1, 3-glucanos (BG) que activan el sistema inmune no específico en peces y crustáceos, y que aumentan la resistencia contra infecciones de bacterias y virus en los camarones peneidos.Se asume que los organismos presentes de manera abundante en los sistemas de biofloc pueden contribuir al mejoramiento de la actividad inmune de los camarones en cultivo. En el presente estudio seleccionamos los seis genes profenoloxidasa 1 (proPO1), profenoloxidasa 2 (proPO2), la enzima 1 de activación de profenoloxidasa (PPAE1), serina proteinasa 1 (SP1), proteinasa similar-enmascarada (mas) y proteína nuclear-ras (Ran), para evaluar el efecto del biofloc en la respuesta inmune del camarón. Estos genes son conocidos por estar directa o indirectamente relacionados a la respuesta inmune no específica del camarón.Como en otros crustáceos, un paso crítico en la respuesta inmune es el reconocimiento de organismos invasores. Un grupo de proteínas, llamadas proteínas de reconocimiento de patrones (PRPs), lo lleva a cabo mediante el reconocimiento y enlace en las moléculas presentes en la superficie de los microorganismos. El enlace de PRPs a los componentes de las paredes celulares de los microorganismos, tales como LPS, PG y ß-1, 3-glucanos, dispara una serie de respuestas que llevan a la activación del sistema inmune del hospedero. Esta serie de respuestas se conoce como el sistema de activación de la profenoloxidasa (proPO), la cual es una de las mayores respuestas inmunes innatas en los invertebrados.En el caso de una herida o una infección, las moléculas de LPS, PG and ß-1, 3-gulcan, reconocidas por las PRPs, llevan a la activación de la cascada de proPO. Esta cascada involucra varios pasos de proteólisis que son catalizados por múltiples clips-SPs. La proteinasa serina (SP), que convierte a los proPO inactivos en su forma activa, es llamada enzima activadora de la profenoloxidasa (PPAE). La proteína de enlace ß-glucano del camarón (BGBP) parece ser una proteína constitutiva del plasma que después de enlazar a la ß-glucano reacciona con la superficie de los hemocitos y estimula la emisión de gránulos hemocíticos.El contenido de los gránulos es activado por la presencia de plasma Ca+, permitiendo la activación del proPO1 y proPO2. El PPAE es el activador directo de proPOs y también es una pieza clave en el sistema de activación de proPOs. El gen mas está reportado por estar relacionado con varias funciones biológicas, incluyendo enlaces y eliminación de bacterias, actividad antimicrobial y adhesión hemocítica. Las proteinasas homólogas mas y serina (SPHs) están implicadas en la activación de la cascada de proPO en los invertebrados.Por otra parte, se sabe que el gen Ran participa en la inmunidad antiviral de Marsupenaeus japonicus y previamente fue encontrado un fragmento de cADN, el cual es altamente homólogo con las proteínas de Ran de un camarón resistente al WSSV. Actualmente se dispone de muy limitada información concerniente al efecto del biofloc en el sistema inmune del camarón. El presente estudio fue diseñado para evaluar el efecto del biofloc en el crecimiento, sobrevivencia y expresión del mRNA en genes relacionados a la inmunidad en postlarvas de L. vannamei.
Materiales y métodosEl experimento se realizó en el Centro de Investigación en Crustáceos del Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo en Pesquerías, en Taean, Corea del Sur. Las postlarvas provinieron de reproductores de L. vannamei libres de patógenos específicos importados de Hawaii, en febrero de 2010. Postlarvas de 20 días de edad fueron colocadas en recipientes circulares de polietileno de 30 L de capacidad, con 20 L de medio de cultivo. Cada recipiente contenía 400 organismos con un peso promedio de 14.12 mg. Anterior al experimento, se pesaron individualmente a 90 postlarvas. Los dos ensayos experimentales se llevaron a cabo por triplicado.El fotoperiodo fue de 14 horas de luz y 10 de oscuridad, y la temperatura se mantuvo a 26-29°C. Las postlarvas fueron mantenidas por 2 semanas. Con base en el medio de cultivo, los grupos experimentales consistieron en uno de biofloc y otro de agua clara que actuó como control. El agua de los recipientes en el grupo de agua clara tuvo un recambio diario del 50% con agua de mar esterilizada con Ozono y filtrada a 5 µ. El agua de los recipientes con biofloc tuvo un recambio diario del 50%, con agua de un sistema de biofloc proveniente de un tanque de cultivo intensivo de camarón donde se cultivaban organismos de 10 g.Cada recipiente tenía un difusor en el centro del fondo. El alimento de las postlarvas contenía un 45% de proteína cruda y fue administrado en tres porciones iguales a las 9, 17 y 22 horas, diariamente. El alimento no ingerido fue retirado en el momento del recambio diario de agua.La temperatura del agua, la salinidad, el pH y el oxígeno disuelto fueron registrados diariamente. Para determinar los valores de amonio total-Nitrógeno, Nitrito-Nitrógeno, Nitrato-Nitrógeno, clorofila “a”, sólidos totales suspendidos (STS) y sólidos volátiles suspendidos (SVS), se tomaba una muestra de un litro (L) de agua de cada recipiente de cultivo cada tres días. Para la medición de compuestos nitrogenados se filtraron sub-muestras de 200 mL a través de filtros de microfibra de vidrio de 1.2 µm de porosidad y fueron analizados antes de 24 horas. Otras sub-muestras de 50 mL fueron tomadas para los análisis de STS, SVS y Chl-a. Para los análisis se siguieron los procedimientos de APHA (1988).
Conteo de bacterias totales Cada tres días se tomaron muestras de cada recipiente de cultivo y se cuantificaron las bacterias por el método de epifluorescencia.
Crecimiento y sobrevivenciaAl final del experimento se pesaron los organismos de cada recipiente y se calculó la sobrevivencia, a partir de los 90 con los que se inició.
Expresión de genes de inmunidad relacionados mediante qRT-PCRCon una técnica Taqman de transcripción cuantitativa por PCR (qRT-PCR) se determinó la expresión de los seis genes seleccionados. Al final del experimento se tomaron tres organismos de cada tratamiento para la extracción total de ARN, con un Mini Kit RNeasy, y luego se purificó con DNase 1. Para el análisis de PCR tiempo real se utilizó el kit ScripTM RT-PCR.
ResultadosCalidad del aguaLa temperatura se mantuvo entre 27.5 y 27.8°C y la salinidad entre 32.3 y 33.3 ppm. El oxígeno disuelto y el pH fueron significativamente diferentes entre el control y el biofloc, ambos más bajos en el tratamiento con biofloc. El promedio del oxígeno disuelto fue de 5.8 a 4.9 y el pH fue de 8.6 y 7.7 en el grupo control y en el grupo con biofloc, respectivamente. El nitrógeno inorgánico (Amonio total AT-N, NO2-N y NO3-N) y la concentración de Clorofila “a” fueron más altos en el grupo con biofloc. Los valores de STS y SVS fueron significativamente diferentes entre los dos grupos, siendo los más altos los del grupo con biofloc (678 vs 13 mg/L). La concentración de Chl-a en el grupo control fue de 1 µg/L, significativamente más baja que el biofloc (25 µg/L). La calidad del agua del tanque de cultivo super-intensivo, de donde se tomó el agua de recambio, fue de AT-N 0.5 mg/L, NO2-N 7.4 mg/L, NO3-N 96.1 mg/L, STS 402.1 mg/L y SVS de 168.9 mg/L, valores promedio.
Conteos bacteriales totales La densidad de bacterias totales en el grupo con biofloc fue significativamente más alto que el grupo control (tabla 3). En el grupo control fueron de 2.59 x 105 a 7.98 x 105 cels/mL (promedio 4.86 x 105 cels/mL), y en el grupo de biofloc fueron de 2.10 x 106 a 1.00 X 107 cels/mL (promedio 5.43 x 106 cels/mL).
Crecimiento y sobrevivenciaLa Tabla 4 presenta los valores de crecimiento y sobrevivencia al día en que terminó el experimento.
Expresión de mRNA de los 6 genes seleccionadosLos resultados se presentan en la Figura 1. Los niveles de expresión de todos los genes de inmunidad relacionados a mRNA en los camarones del grupo con biofloc fueron significativamente superiores al grupo control.
DiscusiónSe encontraron varias diferencias significativas en la calidad del agua entre los dos grupos (tabla 2). El pH fue menor en el grupo con biofloc por la respiración de los organismos heterotróficos. El oxígeno disuelto fue menor en el grupo con biofloc por la alta demanda de bacterias y otros microorganismos. Las lecturas de Chl-a fueron más altas en el tratamiento con biofloc. A pesar de estas diferencias, los parámetros en los dos grupos se mantuvieron en rangos aceptables para la supervivencia y el crecimiento de Litopenaeus vannamei.Se encontraron, así mismo, diferencias significativas en los valores de STS (673 y 13 mg/L) y de SVS (408 y 11 mg/L) en el grupo con biofloc y el control, respectivamente, sin que representaran efectos negativos en las postlarvas. El número de bacterias totales fue mayor en el grupo con biofloc (tabla 3).La sobrevivencia y el crecimiento de las postlarvas del grupo con biofloc fueron significativamente superiores que las del grupo control (tabla 4), como se ha reportado en experimentos similares. Una de las razones es el consumo de biofloc por las postlarvas de camarón, que pueden llegar a representar hasta el 29% de la ingesta diaria.La pared celular microbiana consiste principalmente de peptidoglicanos (PG), lipopolisacaridos (LPS) y ß-1, 3-glucanos, los que disparan el sistema profenoloxidasa (proPO), uno de los mayores sistemas inmunes no específicos en los crustáceos. Se asume que la gran cantidad de bacterias asociadas al biofloc puede contribuir a aumentar la inmunidad y el crecimiento de los camarones, al ser ingeridas. Los seis genes seleccionados son reconocidos por su asociación con la respuesta inmune no específica en los camarones. En el presente estudio, los niveles de expresión de mRNA de los seis genes fueron significativamente más altos en el grupo con biofloc que en el control (figura 1), sugiriendo que el biofloc puede contribuir al aumento de la inmunidad de las postlarvas. Asimismo, la expresión de genes mas es consistente con otros reportes. Nuestros resultados sugieren que el biofloc o la microbiota asociada puede mejorar la expresión de algunos genes selectos que se relacionan con la actividad inmune en L. vannamei.
ConclusionesLos sistemas de biofloc proveen alguna protección contra las enfermedades de los camarones en cultivo, pero hace falta desarrollar evaluaciones científicas al respecto. El presente trabajo aporta evidencia científica de una serie de procesos que incrementan la inmunidad en camarones cuando son cultivados en sistemas con biofloc.El mecanismo inmune del camarón es lábil (de corta memoria), por lo que cuando un patógeno ingresa en un sistema de cultivo, la población no cuenta con un mecanismo inmune inmediato; no es el caso cuando los organismos son cultivados en sistemas con biofloc, a diferencia de los sitemas con agua clara. Se ha planteado que la densa población microbiana asociada al biofloc induce a un disparo permanente del desarrollo y mantenimiento del sistema inmune en el camarón, constituyendo un mecanismo de defensa.El uso de este mecanismo puede ser un importante medio de protección del camarón contra brotes drásticos de enfermedades que han llevado al colapso de empresas camaronícolas con enormes pérdidas económicas. Es preciso  enfatizar que el presente trabajo debe continuarse para demostrar el efecto de la concentración de biofloc en la expresión de los genes de inmunidad.
AgradecimientosEste trabajo fue apoyado por el proyecto ‘Environmentally- friendly BFT shrimp culture technology’ (No. RP-2012-AQ-050), National Fisheries Research & Development Institute (NFRDI), República de Corea.


* © 2013 Los Autores. Investigación en Acuicultura Publicado por John Wiley & Sons Ltd. 



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