Artículos y entrevistas de mayo 2009

 

Los problemas señalados anteriormente con las técnicas de hipofisación llevaron a desarrollar la obtención de preparados de LH, total o parcialmente purificados, a través de separación cromatográfica, aun cuando incorpora un alto costo al producto final. Preparaciones purificadas de gonadotrofinas de salmón y carpa han sido comercializadas hace algún tiempo (Harvey y Hoar 1980, Davy y Chouinard 1980, Peter y Yu 1997, Zohar y Mylonas 2001). Sin embargo, debido a la alta especificidad de las gonadotrofinas se han obtenido escasos resultados con gonadotrofinas heterólogas aun en peces filogenéticamente cercanos (Zohar 1988, Estay y col 1996, Peter y Yu 1997, Patiño 1997).

 

 

Numerosas investigaciones fueron realizadas con el fin obtener una gonadotrofina purificada cuya actividad pueda estandarizarse y proveerse en forma regular, de manera de reemplazar los extractos crudos de hipófisis (Donaldson y col 1972, Harvey y Hoar 1980, Davy y Chouinard 1980). Uno de los productos más utilizados por algún tiempo fue la gonadotrofina parcialmente purificada de salmón (SG-G100), pero las altas dosis requeridas (aprox. 10 mg/kg) incrementaban los costos; el desarrollo de respuesta inmune en el pez receptor, su sensibilidad térmica y su bajo efecto producto de su especificidad redujeron sus aplicaciones productivas (Harvey y Hoar 1980, Mylonas y Zohar 2001b, Zohar y Mylonas 2001).

 

 

Con el fin de optimizar los resultados obtenidos en la sincronización de la maduración de peces, a principio de la década del 70 se llegó a investigar con gonadotrofinas de mamíferos, especialmente gonadotrofina coriónica de yegua y humana (hCG), purificada desde la orina de mujeres embarazadas (Harvey y Hoar 1980, Katzman y Doisy 1932 citado por Zohar y Mylonas 2001). Consecuentemente, la hCG ha sido utilizada en la inducción del desove de algunas especies de peces cultivadas hoy en día (Harvey y Hoar 1980, Donaldson y Hunter 1983, Billard y Breton 1985, Rowland 1988, Cerqueira y col 1997) y su éxito por lo general se ha atribuido a una actividad semejante a la LH (Hoar 1969, Chaudhuri 1976 citado por Harvey y Hoar 1980).

 

Durante su aplicación, la hCG se utiliza en una dosis simple, lo que reduce la manipulación de los peces en comparación al uso de la técnica de hipofisación. La efectividad de una dosis única se debe probablemente al largo tiempo en circulación que permanece la hormona (Ohta y Tanaka 1997). Las concentraciones utilizadas se encuentran entre 100 y 4.000 UI por kg de peso del pez. Los resultados de su uso se mejoran notoriamente cuando se utiliza en combinación con la inyección de extractos de hipófisis (Harvey y Hoar 1980, Amutio y col 1986). La ventaja de esta hormona es que ella actúa directamente sobre la gónada y no requiere la activación de la glándula hipófisis, actuando así mucho más rápido, induciendo la maduración final del oocito, la espermiación y la puesta. Sin embargo, la hCG puede causar inmunorreacciones en el pez receptor, reduciendo o eliminando el efecto de la hormona en inyecciones posteriores (Patiño 1997).

 

Hormonas liberadoras de gonadotrofinas (GnRHy LH-RH) y sus análogos (GnRHa y LH-RHa). Los métodos más modernos de inducción a la ovulación se han centrado en la aplicación de hormonas liberadoras de gonadotrofinas (GnRH). Estas son moléculas pequeñas (decapéptidos) que realizan el control de la glándula hipófisis en su producción de gonadotrofinas (LH y FSH o GtH-I y GtH-II) (Montero y Dufour 1996, Patiño 1997). Con la creación de análogos sintéticos (LH-RHa y GnRHa) que resultaron más potentes y de mayor duración que los nativos, se generó su masificación (Zohar 1988, Peter y Yu 1997, Patiño 1997). Los preparados sintéticos o análogos son nonapeptidos (Estay y col 1996, Donaldson 1997). En la mayoría de ellos se han sustituido los aminoácidos de las posiciones 6,7 u 8 en relación a la molécula de GnRH de mamíferos y carecen de glicina en posición 10 (Estay y col 1996); siendo utilizados en numerosas especies (Billard y col 1983, Carrillo y Zanuy 1995) como la carpa (Davy y Chouinard 1980, Peter y col 1988); salmónidos (Billard y Breton 1985, Estay 1996, Kitahashi y col 1998a); lubina (Sorberá y col 1996); loja (Peter y col 1988); en la lisa (Mugil cephalus) (Lee y Támara 1988); en "milkfish" (Chanos chanos) (Tamaru y col 1988 y Marte y col 1988); en "rabbitfish" (Siganus guttatus) (García y col 1993); en perca amarilla (Perca flavescens) (Dabrowski y col 1994); esturión del Atlántico (Acipenser oxyrinchus) (Moler y Fletcher 1999), entre otras especies.

 

Las ventajas de la aplicación de hormonas liberadoras (GnRH) en la inducción de la puesta en peces sobre los preparados de GtH son resumidas por Zohar y Mylonas (2001):

 

- Las GnRH son pequeñas moléculas que no generan respuestas inmunes en los peces receptores, por lo que pueden ser utilizadas repetidas veces.

- Las GnRH "reparan" las alteraciones endocrinas producidas por el cautiverio y llevan a los peces a su maduración sexual plena.

- Las GnRH se producen a nivel del hipotálamo, el cual controla la secreción de otras hormonas importantes en la homeostasis del pez, como son la prolactina, somatotropina y tirotropina.

- El poder sintetizarlas y obtenerlas en forma pura evita el riesgo de transmitir enfermedades a los peces receptores.

- Finalmente, la estructura molecular de estas hormonas es muy similar en muchos peces, lo que permite su uso en un gran número de especies con gran efectividad.

 

Una inyección de GnRH induce un incremento inmediato en los niveles plasmáticos de GtH en muchos peces, pero durante un periodo corto de tiempo durante el cual se debe activar la maduración final de los oocitos, la espermiación o la puesta. La corta vida media de las GnRH es producto de la acción de endopeptidasas ubicadas en la hipófisis, hígado y riñon (Peter y Yu 1997) que actúan en los enlaces peptídicos en posición 5-6 y 9-10, transformándola en pequeños fragmentos inactivos. En los análogos sintéticos, se han sustituido en esas posiciones aminoácidos D y con etilamida, respectivamente, esto los hace resistentes a la acción enzimática y presentan una vida media mucho mayor que las hormonas nativas (aproximadamente 23 y 5 min, respectivamente) y la calidad de las puestas no difiere de la obtenida en los peces controles (Carrillo y Zanuy 1995, Peter y Yu 1997; Zohar y Mylonas 2001, Mylonas y Zohar 2001b).

 

De esta manera, la GnRHa permanece en circulación mucho más tiempo y estimula una mayor producción de GtH por más tiempo. Además, pueden presentar una mayor afinidad por los receptores de la hipófisis (Zohar y Mylonas 2001, Mylonas y Zohar 2001b). Estos factores dan como resultado una acción 30 a 100 veces más potente en los análogos, lo que ha hecho que estas hormonas sustituyan prácticamente todas las otras sustancias utilizadas en las terapias hormonales aplicadas a peces. Se debe considerar además que los análogos requieren dosis mucho más bajas que las hormonas nativas. De 1 a 15 mg de GtH/kg de pez frente ala 100 µg de GnRHa/kg de pez.

 

La dopamina es una hormona que actúa a nivel de la hipófisis en algunos peces inhibiendo la liberación de GtH y atenuando la acción de la GnRH en las gonadotrofinas (Zohar 1988, Peter y Yu 1997). Por lo anterior, antagonistas de la acción de la dopamina (domperidone, pimozide, reserpine o metoclopramida) han sido utilizadas en combinación con GnRHa en la inducción de la maduración en algunas especies (Peter y col 1988, Peter y Yu 1997, Patiño 1997, Zohar y Mylonas 2001, Mylonas y Zohar 2001b), estando bien establecida su efectividad en ciprínidos y algunas especies de agua dulce (Zohar y col 1995). En cambio, la utilización de inhibidores dopaminérgicos tiene resultados pobres y es poco recomendable su uso en la lubina americana y otras especies marinas (Carrillo y col 1995). Thomas y col (1995) señalan que el sistema dopaminérgico inhibidor de la secreción de GtHII está bloqueado en especies como la corvina, "spotted sea trout", "red drum" y "Atlantic croaker".

 

La aromatasa es una enzima que realiza la conversión de testosterona (T) a 17ß-estradiol (E2) en el ovario; esta hormona es la encargada de estimular al hígado para la producción de vitelogenina. Recientes investigaciones han evaluado el uso de inhibidores de aromatasa (fadro-zole) junto a GnRHa con el fin de inducir la maduración final del oocito y la espermiación en peces. Un inhibidor de la aromatasa bloquea la conversión de T a E2 en el ovario y de esta manera se genera el incremento en los niveles del esteroide inductor de la maduración (17α, 20ß -dihidroxi-4-pregne-3-one) y de la ovulación (Alfonso y col 1999 citado por Zohar y Mylonas 2001).

 

 

La forma de aplicación de estos productos ha sido estudiada por numerosos autores y evaluadas en muchas especies (Peter y col 1988, Zohar 1988, Donaldson 1997, Patiño 1997). La mayoría de ellas se inician con aplicaciones en un medio líquido para llegar en la actualidad al uso de compuestos biodegradables capaces de regular la liberación de la hormona incorporada en el producto. A continuación se realiza una descripción breve de las formas de aplicación más utilizadas en sistemas de producción en acuicultura.

 

 

Suero fisiológico. Su uso ha sido aplicado desde la incorporación de la hipofisación, sin embargo, la mayor desventaja se traduce en que toda la hormona incorporada en él queda inmediatamente a disposición del torrente circulatorio del pez, de manera que su entrega es durante un breve periodo. Por lo anterior, será necesaria más de una inyección para inducir la ovulación en la mayoría de las especies.

 

 

Implantes. Los primeros sistemas de liberación lenta fueron preparados a base de colesterol (Crim y col 1988, Sherwood y col 1988, García 1989,1993) y posteriormente evaluados en varias especies de salmónidos (Donaldson y Hunter 1983, Weil y Crim 1983 citado por Zohar y Mylonas 2001, Crim y col 1988, Bromage y Cumaranatunga 1988, Billard 1992, Estay y col 1996, Zohar y Mylonas 2001), en Lates calcarifer (García, 1989), en Dicentrarchus labrax (Carrillo y col 1995, Forniés y col 2001), en Paralichthys orbignyanus (Cerqueira y col 1997) y en numerosas especies de peces de interés comercial. En la actualidad se pueden preparar mezclados con celulosa y sus proporciones determinan implantes de liberación lenta (durante ocho semanas) o rápida (durante ocho días). Regularmente cada "pellet" contiene entre 25 y 250 ug de hormona y pueden ser aplicados en forma intramuscular o intraperitoneal (Crim y col 1988, Sherwood y col 1988, Varas 1996, Zohar y Mylonas 2001, Mylonas y Zohar 2001b). Estos "pellet" entregan cerca del 50% de la hormona contenida dentro de 2-3 hrs y el 90% a las 5-6 hrs (Crim y col 1988). Sin embargo, Sherwood y col 1988 reportan que un implante preparado con 95% de colesterol y 5% de celulosa sólo libera entre un 36 a 38% de la hormona contenida después de veintiocho días. Este mayor tiempo de liberación facilita la acción biológica de la hormona y además amplía el tiempo que tiene el piscicultor para implantar los peces, los que no necesariamente deben ser inyectados cuando la vesícula germinal se encuentra migrando, como ocurre cuando se utilizan medios líquidos.

 

Microesferas. La alta rigidez, baja degradabilidad y acelerada entrega de la hormona en los implantes han llevado a buscar nuevos compuestos que faciliten su manejo y prolonguen el tiempo de liberación de la hormona contenida. Debido a lo anterior, en peces se ha realizado la evaluación de polímeros biodegradables, de menor tamaño y mayor flexibilidad. Las evaluaciones más exitosas se han realizado con polímeros de Ac. Láctico y Ac. Glicólico (LGA), Ac. Sebásico (Fad-sa) y Acetato de etilen vinílico (EVAc). Sus mayores ventajas se centran en el prolongado tiempo de liberación de la hormona, su carácter biodegradable, facilidad de aplicación y fabricación (Zohar y Mylonas 2001, Mylonas y Zohar 2001b). Forniés y col (2001) comparan la efectividad de diferentes sistemas de liberación lenta en D. labrax, determinando que las microesferas indujeron un mayor número de puestas y sin efectos negativos en la calidad de los gametos producidos en comparación a implantes de EVAc con 50 µg/kg o una inyección en suero salino con 15 µg/kg.

 

Además de estas formas variadas de inducción a la maduración final del oocito en peces de cultivo y que requieren de repetidos manejos que pueden llevar a la muerte del animal (Patiño 1997), también se ha examinado en peces el uso potencial de la administración oral de las hormonas. Aunque los resultados han sido promisorios, este método no ha sido estudiado completamente (Thomas y Boyd 1989, Solar y col 1990, McLean y col 1991, Sukumasavin y col 1992, Patiño 1997, Donaldson 1997). Thomas y Boyd (1989) informan de la utilización de GnRHa administrada en el alimento para inducir la puesta sin deteriorar la calidad de gametos en la trucha de mar (Cynoscion negulosus), carpa (C. carpió), trucha arcoiris (O. mykiss) y en el pez gato africano (Ciarías gariepinus). Esta técnica de suministro de la hormona presenta perspectivas promisorias para la acuicultura, ya que reduce el manejo de los peces a una simple biopsia ovárica para elegir el momento apropiado en que se debe iniciar el tratamiento (Patiño 1997).

 

 

Cualquiera sea el método de aplicación o el vehículo utilizado en la inducción a la puesta que se pretenda realizar, es fundamental conocer el estado de maduración en el que se encuentran las células germinales. Recordando siempre que los tratamientos sólo serán efectivos si los oocitos se encuentran en su fase de maduración final y el reproductor es manejado adecuadamente, manteniéndolo con bajos niveles de estrés. Importantes investigadores del tema recomiendan la aplicación de los tratamientos durante las primeras horas de la mañana y además identificar el momento en que la vesícula germinal se encuentra migrando a la periferia del oocito, momento en que la efectividad de una inyección será más efectiva1.

 

 

En la actualidad existe una variada gama de terapias hormonales disponibles para el piscicultor y que son factibles de utilizar en sus procesos productivos. ¿Cuál es la más recomendable?, dependerá de la especie que se cultiva y de los recursos con que se cuenta para adquirirla. La tendencia es a masificar el uso de productos análogos por su alta eficiencia, mayor vida útil y la ausencia de respuesta inmune en los peces receptores. Se debe continuar buscando reducir los costos de estos productos y buscar formas de aplicación menos invasivas para el pez (y menos agotadoras para el personal de la piscicultura). En la actualidad en la salmonicultura chilena, por ejemplo, el uso de implantes de GnRHa es una actividad rutinaria a pesar de su alto costo.

 

 

Se agradece el apoyo del proyecto FONDEF D06I1020 y a la Dirección de Investigación de la Universidad Católica de Temuco a través del proyecto DGIUCTemuco N° 2007-DGI-CDA-05. Además, al Dr. Adrián Hernández por la elaboración del resumen en inglés.